ПЦР, бул полимераздык чынжыр реакциясы, ал ДНК полимеразанын катализинде системага dNTP, Mg2+, узартуу факторлору жана күчтөндүрүү факторлорунун кошулушун билдирет, негизги ДНКны калып катары жана спецификалык праймерлерди узартуунун баштапкы чекити катары колдонуу, Денатурация, күйгүзүү, узартуу, ж.б. этаптары аркылуу, ДНКнын ата-эне тилкесинин шаблонуна толуктоочу кыз тилкесин in vitro репликациялоо процесси in vitro каалаган максаттуу ДНКны тез жана атайын күчөтө алат.
1. Hot Start PCR
Кадимки ПТРде күчөтүүнү баштоо убактысы ПТР машинасын ПТР машинасына салуу эмес, андан кийин программа күчөй баштайт.Системанын конфигурациясы аяктагандан кийин, күчөтүү башталат, ал спецификалык эмес күчөтүүгө алып келиши мүмкүн жана ысык баштоо ПТР бул көйгөйдү чече алат.
ысык баштоо ПТР деген эмне?Реакция системасы даярдалгандан кийин фермент модификатору реакциянын алгачкы ысытуу стадиясында же “ысык баштоо” стадиясында жогорку температурада (көбүнчө 90°Сден жогору) чыгарылып, ДНК полимераза активдештирилет.Так активдештирүү убактысы жана температурасы ДНК полимеразасынын жана ысык баштоо модификациясынын табиятынан көз каранды.Бул ыкма негизинен ДНК полимеразанын активдүүлүгүнө бөгөт коюу үчүн антителолор, жакындык лиганддар же химиялык модификаторлор сыяктуу модификаторлорду колдонот.ДНК полимеразанын активдүүлүгү бөлмө температурасында ингибирленгендиктен, ысык баштоо технологиясы ПТР реакцияларынын өзгөчөлүгүн жоготпостон, бөлмө температурасында бир нече ПТР реакция системаларын даярдоо үчүн чоң ыңгайлуулукту камсыз кылат.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transscription PCR) – мРНКдан кДНКга тескери транскрипциялоонун жана аны күчөтүү үчүн шаблон катары колдонуунун эксперименталдык ыкмасы.Эксперименттик процедура биринчиден ткандарда же клеткаларда жалпы РНКны бөлүп алуу, праймер катары Олиго (dT) колдонуу, cDNAны синтездөө үчүн тескери транскриптазаны колдонуу, андан кийин максаттуу генди алуу же ген экспрессиясын аныктоо үчүн ПТР күчөтүү үчүн шаблон катары cDNAны колдонуу.
3. Флуоресценттик сандык ПТР
Флуоресценттик сандык ПТР (реалдуу убакыттагы сандык ПТР,RT-qPCR) флуоресценттик топторду ПТР реакциясынын системасына кошуу ыкмасын билдирет, флуоресценттик сигналдардын топтолушун колдонуп, реалдуу убакытта бүт ПТР процессине мониторинг жүргүзүү жана акырында калыпты сандык анализдөө үчүн стандарттык ийри сызыкты колдонуу.Көбүнчө колдонулган qPCR ыкмаларына SYBR Green I жана TaqMan кирет.
4. Уюшкан ПТР
Уюшкан ПТР ПТРди күчөтүүнүн эки айлампасы үчүн ПТР праймерлеринин эки топтомун колдонууну билдирет, ал эми экинчи раунддун күчөтүү продуктусу максаттуу ген фрагменти болуп саналат.
Эгерде биринчи жуп праймерлердин (сырткы праймерлердин) дал келбегендиги спецификалык эмес продукттун күчөшүнө алып келсе, ошол эле спецификалык эмес аймактын экинчи жуп праймерлер тарабынан таанылышы жана күчөтүүнү улантуу мүмкүнчүлүгү өтө аз, ошондуктан праймерлердин экинчи жубу менен күчөтүү, ПЦР өзгөчөлүгү жакшырды.ПТРдин эки раундунун аткарылышынын бир артыкчылыгы, ал чектелген баштапкы ДНКдан жетиштүү продуктуну көбөйтүүгө жардам берет.
5. ПТР
Touchdown ПТР – бул ПТР циклинин параметрлерин тууралоо аркылуу ПТР реакциясынын өзгөчөлүгүн жакшыртуу ыкмасы.
Тийиштүү ПТРде алгачкы бир нече цикл үчүн күйдүрүү температурасы праймерлердин максималдуу күйгүзүү температурасынан (Tm) бир нече градуска жогору коюлат.Жогорку күйдүрүү температурасы спецификалык эмес күчөтүүнү эффективдүү азайтышы мүмкүн, бирок ошол эле учурда жогорку күйдүрүү температурасы праймерлердин жана максаттуу ырааттуулуктун бөлүнүшүн начарлатат, натыйжада ПТР түшүмдүүлүгү төмөндөйт.Ошондуктан, алгачкы бир нече циклде, системадагы максаттуу гендин мазмунун жогорулатуу үчүн, күйдүрүү температурасы, адатта, цикл сайын 1°C төмөндөйт.Күйүү температурасы оптималдуу температурага чейин түшүрүлгөндө, калган циклдер үчүн күйдүрүү температурасы сакталат.
6. Түздөн-түз ПТР
Түздөн-түз ПТР нуклеиндик кислотаны изоляциялоону жана тазалоону талап кылбастан, түздөн-түз үлгүдөн максаттуу ДНКны күчөтүүнү билдирет.
Түз ПТРдин эки түрү бар:
түз ыкма: үлгүнүн аз көлөмүн алып, аны ПТР идентификациясы үчүн түздөн-түз ПЦР Мастер Микске кошуу;
крекинг ыкмасы: үлгүнү тандап алгандан кийин, аны лизатка кошуп, геномду чыгаруу үчүн лиза, лизденген супернатанттын бир аз көлөмүн алып, аны ПТР Мастер Миксине кошуу, ПТР идентификациясын жүргүзүү.Бул ыкма эксперименталдык ишти жөнөкөйлөштүрөт, практикалык иштөө убактысын кыскартат жана тазалоо кадамдары учурунда ДНКны жоготуудан сактайт.
7. SOE PCR
ПТРдин (SOE ПТР) бири-бирин кайталаган узартылышы аркылуу генди бириктирүү ПТР продуктуларын бири-бирин кайталаган чынжырларды түзүү үчүн кошумча учтары бар праймерлерди колдонот, ошентип кийинки күчөтүү реакциясында бири-бирин кайталаган чынжырларды узартуу аркылуу, күчөтүлгөн фрагменттердин бири-бирине дал келген А техникасынын ар кандай булактары колдонулат. жана бириктирилген.Бул технология учурда эки негизги колдонуу багыттары бар: синтез гендерин куруу;гендик сайтка багытталган мутация.
8. IPCR
Тескери ПТР (IPCR) эки праймерден башка ДНК фрагменттерин күчөтүү үчүн тескери толуктоочу праймерлерди колдонот жана белгилүү ДНК фрагментинин эки тарабында белгисиз ырааттуулуктарды күчөтөт.
IPCR алгач чектеш белгисиз аймактардын ырааттуулугун аныктоо үчүн иштелип чыккан жана көбүнчө ген промоутер ырааттуулугун изилдөө үчүн колдонулат;гендердин синтези, транслокациясы жана транспозициясы сыяктуу онкогендик хромосомалардын кайра түзүлүшү;жана вирустук гендердин интеграциясы азыр да кеңири колдонулат. Сайтка багытталган мутагенез үчүн плазмидди керектүү мутация менен көчүрүңүз.
9. dPCR
Санарип ПТР (dPCR) нуклеиндик кислотанын молекулаларынын абсолюттук сандык аныктоо ыкмасы болуп саналат.
Азыркы учурда нуклеин кислотасынын молекулаларынын санын аныктоонун үч ыкмасы бар.Фотометрия нуклеин кислотасынын молекулаларынын сиңирүүсүнө негизделген;реалдуу убакыттагы флуоресценттик сандык ПТР (Real Time PCR) Ct маанисине негизделет, ал эми Ct мааниси аныктала турган флуоресценттик мааниге туура келген цикл номерин билдирет;санариптик ПТР – бул нуклеин кислотасын саноо үчүн бир молекулалуу ПТР ыкмасына негизделген эң акыркы Сандык технология, абсолюттук сандык метод.
Посттун убактысы: 13-июнь-2023